Azoospermia

Şiddetli erkek infertilitesinin en ileri noktasıdır.Menide sperm bulunmaması durumudur.

Obstruktif azoospermia: Burada erkeğin yumurtalıklarında (testis) sperm hücre yapımı olmasına rağmen hücreleri ileten kanallarda tıkanıklık olması nedeniyle sperm hücreleri meniye ulaşamaz. Bu hastalarda enjektör ve iğne yardımı ile sperm kanallarından hücre alınır. (tesa, mesa, pesa)
Non-obstructif azoospermia (NOA): Burada ise sperm hücresini yapımı ya hiç olmamakta, ya da hücre olgunlaşması tamamlanamadığı olgun sperm hücresi bulunmamaktadır. Bu tip azospermi pek çok nedenden olabilir: Ör: İnmemiş testis, genetik kaynaklı gibi. Bu hastalarda testislerden iğne yardımı ile hücre aranır (tesa). Eğer hücre bulunamazsa testislerden biyopsi ile çok küçük parçalar alınır ve hücre aranır (tese, mikrotese)
Her iki azospermi tipinin ayırıcı tanısında
Sperm analizi
Erkeğin muayenesi
Erkeğin hormon tetkiklerinin
Erkeğin genetik tetkikinin yapılması gerekir.
Azoospermik Erkeklerde Cerrahi Yol İle Sperm Elde Edilmesi
Cerrahi yol ile sperm elde etme tekniklerinde üç noktaya dikkat edilmelidir;
Mümkün olan en iyi kalitede sperm elde edilmeli
Hemen kullanım ve krioprezervasyon için yeterli sayıda sperm elde edilmeli
Reprodüktif sistem hasarını minimal düzeyde tutarak daha sonraki sperm elde etme veya cerrahi rekonstrüksiyon engellenmemelidir.
 

Mikro Cerrahi İle Epididimal Sperm Elde Edilmesi (MESA)
Erkek hastaların bir bölümünde spermlerin dışarıya boşalmasını sağlayan kanallarda doğuştan, daha sonra geçirilen enfeksiyon veya cerrahiye bağlı olarak bir tıkanıklık olabilir. Bu grup hastalarda sperm alabilmek için mikroskop altında spermlerin dışarıya boşalmadan önce depolandığı ve epididim adı verilen bölgeye açık cerrahi yöntemle girilerek sperm alınmasına MESA denir.

IVF uygulamalarında MESA ile elde edilen spermden ilk gebelik 1985’de Temple-Smith ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir.
GAA veya RAA altında yapılabilir.
Ortalama işlem süresi ~ 1 saat.
İşlem mikrocerrahi eğitimini ve gereçlerini gerektirir.
Endikasyonlar:
Konjenital bilateral vaz deferans agenezisi
Cerrahi ile düzeltilemeyen epididim ve vaz deferans obstruksiyonu
Başarısız genital trakt anastomozları
Young sendromu
Spinal kord yaralanmasına veya diyabete bağlı anejakülasyon
Retrograd ejakülasyon
Bu tür hastalarda sperm elde etmek için daha önceleri kullanılan bu teknik dünyada yerini artık PESA’ya bırakmıştır. Bununla birlikte Dr Tanaka’nın uyguladığı yeni MESA yöntemi ile bu teknik kullanılarak daha yüksek oranda sperm ve hücre bulunması sağlanmıştır ve Tanaka metod olarak azospermi tedavisinde yerini almıştır.



Perkütan Sperm Aspirasyonu (PESA)
Endikasyonlar:
Bilateral konjenital vaz agenezis
Bilateral vaz obstrüksiyonları (enfeksiyon, travma gibi)
Prostatik seviyede ejekülatuvar kanal obstrüksiyonları
Rete testis obstrüksiyonlarında ve non-obstrüktif azoospermilerde epididim boş olarak palpe edilir ve PESA ile sperm elde edilemez.

PESA Avantajları:
Daha az anesteziye ihtiyaç duyulur
Skrotal eksplorasyonun gerektirmez
Postoperatif rahatsızlık minimumdur
Kolayca tekrarlanabilir
Mikkrocerrahi yöntemlere göre daha ucuzdur
Mikrocerrahi eğitimi gerektirmez.
PESA Dezavantajları;
MESA spermleri ile elde edilenlere oranla canlılık oranları daha düşüktür
Kriyoprezervasyon için yeterli sperm elde edilemeyebilir
Komşu dokulara hasar verme riski daha yüksektir
4. Spermler kan hücreleri ile kontamine olabilir.



PESA kanallardaki tıkanıklığa bağlı olarak spermin dışarıya boşalamadığı hastalarda ciltten iğne ile epididime girilerek sperm alınmasıdır.

Sperm elde etmede etkili ve güvenli bir yöntemdir. Başarı oranı %83’dür.
İşlem süresi çok kısadır (~15 dakika).
Epididimin dolgun olarak ele geldiği olgularda
öncelikle uygulanması gereken bir tekniktir.


PESA ile sperm eldesi

Testiküler sperm aspirasyonu (TESA)
Endikasyonlar:
Epididimlerin yapısı MESA veya PESA işlemine uygun olmayan obstrüktif azoospermi olguları
Daha öne uygulanan diagnostik TESE sonucunda yaygın hipospermatogenezis alanları bulunan olgular
Testiküler aspirasyon 19 G iğne ile gerçekleştirilir. Perkütan testiküler biyopsiye göre daha az ağrılı ve risklidir. Aspirasyon materyeli korunması için medium içine konur. Buradan alınacak bir damlanın lam üzerinde ve mikroskop altında hemen incelenmesi ile sperm varlığı ve hareketliliği o anda test edilebilir. Sperm bulunana kadar aynı testisten 3 – 4 aspirasyon yapılabilir.

TESA  işlemi doğuştan veya daha sonra testisleri etkileyen bir nedene bağlı olarak sperm üretiminin yetersiz olduğu ve sperm tahlilinde hiç sperm görülmeyen hastalarda testise bir iğne ile girilerek sperm elde edilmesidir. Ayrıca tıkanıklığa bağlı olarak spermin dışarıya boşalamadığı hastalarda PESA işlemi ile sperm bulunamazsa yine TESA işlemi alternatif olarak kullanılmaktadır. Diğer bir grup hasta ise sperm tahlilinde sperm olmasına karşın, hiç hareketli spermi olmayan ve sperm sayısı 1×106/ml üzerindeki hastalardır. Bu grup hastalara da TESA başarı ile uygulanır.

Epididimin MESA ya da PESA gibi işlemlere uygun olmadığı veya hipospermatogenezisi olduğu bilinen olgularda uygulanabilen minimal invazif bir girişimdir.


TESA ile sperm eldesi

Testiküler Sperm Ekstraksiyonu(TESE)
TESE işlemi ile sperm elde edilmesi, hastanın eşinin kontrollü ovarian hiperstimülasyon uygulaması ile eş zamanlı olarak yapılmaktadır. TESE işleminin,  hastanın daha önce geçirmiş olduğu testis biyopsisi veya diğer inguinal/skrotal girişimden 6 ay sonrasına planlanması gereklidir. Biyopsiler sırasında da optikal magnifikasyondan faydalanılabilir.

TESE yukarıdaki yöntemlerle sperm bulunmayan hastalarda testislerin doğrudan cerrahi yöntemle açılarak alınan doku parçalarından sperm elde edilmesidir. Testisten doku örneği elde edilmesinde dikkat edilecek olan nokta, tek bir alandan geniş bir dokunun çıkartılmasından ziyade, haritalama tarzında birden çok alandan daha küçük parçalar alınması ve bu şekilde testisin bir nevi haritasının çıkartılmasıdır.

Açık biyopsi ile testisten alınan doku parçasının parçalanarak içinden sperm elde etmeye yönelik bir işlemdir.
Özellikle NOA olan olgularda ICSI için gerekli olan spermin sağlanması için uygulanır.
NOA’li olgularda TESE ile sperm elde etme oranı yaklaşık %50 olarak bildirilmektedir.
Tekrarlayan TESE olgularında en az 6 aylık ara verilmesi gereklidir.

Testisten doku örneği alınması

Mikrodiseksiyon TESE                                     
Günümüzde mikrodisseksiyon yöntemi ile mikroskop altında testis biopsisi gerçekleştirilmekte ve sperm bulma şansı arttırılmaktadır. NOA (Non-Obstrüktif Azoospermi) erkek populasyonunda %1, buna karşın erkek infertilitesi nedeniyle izlenen hasta grubunda %10 kadar görülür. Bu grup hastada tanı testis biyopsisi ile konulmakta ve çoğunlukla Sertoli Cell Only (germ hücre aplazisi), maturasyon arresti yada hipospermatogenezis gibi histopatolojik tanılar rapor edilmektedir. Teorik olarak sperm bulunması beklenmeyen, ön tanıları hipospermatogenez olan olgularda TESE ile %81, maturasyon arresti olgularda %42 ve sertoli cell only olan olgularda %24 oranında sperm bulunmuştur. Bu bulgu testis içinde küçük odaklar halinde sperm üreten tubulusların olabileceğini kanıtlamıştır. Son yıllarda bu odakları bulma şansını arttıracak bir yöntem olan, Mikrodiseksiyon TESE önerilmektedir.

Mikrodiseksiyon TESE; testis açıldıktan sonra rastgele parça almak yerine operasyon mikroskobu kullanarak dilate tübüllerin tespit edilip alınması prensibine dayanır. Operasyon mikroskobunun sağladığı 20-30X büyütme sonucu seminifer tübüller rahat görülebilir konuma gelirler. Bu koşullarda içinde bol hücre ve sperm hücresi içeren tübüller diğerlerine göre daha dilate ve opak beyaz görülürler. İçinde sperm olma olasılığı olan bu tübüller mikrocerrahi pensetlerle toplanırlar ve hemen sonra androloglar tarafından parçalanıp sperm içerip içermediklerine bakılırlar.



Sadece tübül toplandığı için klasik doku biyopsisinden 70 kat daha az doku testisden çıkarılır ve bu durum testisten daha az doku hasarı ve kaybı , testesteron miktarının daha az etkilenmesi ve daha düşük testiküler travma anlamına gelir. Mikrodiseksiyon TESE ile bu yöntemin öncüsü olan Dr. Schlegel %36 olan eski sperm bulma oranlarının %68’e yükseldiğini açıklamıştır. Daha sonra birçok grup bu bulguyu destekleyen kendi çalışmalarını yayınlamışlardır.


Mikrodiseksiyon TESE işlemi

Infertil Erkeğin Değerlendirilmesinde Testis Biyopsisi:
Testis biyopsisi farklı amaçlarla uygulanmaktadır:
1.Azoospermi olgularında duktal obstrüksiyon ile intrinsik testiküler disfonksiyon ayırt edilebilir.

2.Oligospermik hastalarda da testiküler histoloji tanımlanabilir.

3.Olası testiküler malignansiler tanımlanabilir.

Testis biyopsisi daima bilateral olarak gerçekleştirilmelidir. Doku örneklemesinde çoklu parça alınarak incelenmesi, testisin tümünü temsil etmesi açısından çok önemlidir.

Testiküler biyopsi tekniğinde skrotum kesilerek testise ulaşılır. Spermatik kord ve skrotal insizyon hattı lidokain ile infiltre edilerek bölgesel anestezi sağlanır. Alınan parçalar patolojik inceleme öncesi fiksatife aktarılır.


Testis biyopsi sonrası tübüllerin mekanik diseksiyonu

Testis Biopsisinin Yorumlanması
Doğru bir şekilde korunmuş ve fikse edilmiş doku örneğinin ışık mikroskobu ile değerlendirilmesi tanı için çok değerli bilgiler verir. Olgun spermatidlerin ve spermatozoaların, diğer germ hücre serilerinden ayrılması kolaydır. Tubul başına ortalama en az 20 olgun spermatozoa olması toplamda en az 10 milyon spermatozoa anlamına gelir.

Histopatolojik incelemede her testis için en az 100 adet tübül değerlendirilmeye alınmalıdır. Alınan örnekte yeterli sayıda tübül bulunamazsa bu durum rapor edilmelidir. Her bir tübül içindeki olgun spermatid ve/veya spermatozoa  sayısı 20 veya daha fazla olduğunda o tübül için ‘normal spermatogenez’, 20’den az olduğunda ise ‘hipospermatogenez’ tanımı kullanılmalıdır. Spermatogonia’dan spermatosit evresine kadar maturasyonun  gözlendiği ancak daha ileri matürasyona sahip hücre görülmediğinde, tüm matürasyon evreleri belirtilerek ‘maturasyon arresti’ tanımı kullanılmalıdır. Eğer germ hücresi görülemiyor, sadece Sertoli hücreleri izleniyorsa ‘germ hücre aplazisi’ terimi kullanılmalıdır. Testiküler patoloji, testisde heterojen bir yapı gösterebildiğinden sonuçta tek bir tanı yerine normal spermatogenez, hipospermatogenez, maturasyon arresti, germ hücre aplazisi veya tubüler skleroz gösteren tubüllerin oranı rapor edilmelidir.

Sperm ön hücrelerinin tanımlanması ve seçimi :
Non-obstrüktif azoospermik hasta örneklerinde (ejakülat yada testiküler) spermatid dominant hücre grubu değildir. Özellikle round spermatidlerin diğer yuvarlak hücrelerden ayrılıp seçilmesi hayli tecrübe isteyen işlemlerdir. Bu tecrübe ise ancak hasta örneklerinde bulunan tüm hücre gruplarının tek tek, düzenli olarak tanımlanması ile elde edilebilir. Böylece hücrelerin sitolojik boyalar veya özel işaretleyiciler kullanılarak detaylı sınıflandırılması mümkündür. Round spermatid tanımlamalarında iki temel teknik ortaya konulmuştur:

Spermatid hücresinde gelişmekte olan akrozomal bölümün içerdiği akrozin miktarının floresan içeren pisium sativum aglutinin ile boyanarak spermatidin gelişim veya arrest düzeyini yansıtır.
Monoklonal antikor kullanımı ile proakrozin miktarının daha özel olarak görüntülenmesi esasına dayanır. Bu metod daha sonra haploid hücrelerin FISH tekniği ile tanımlandığı protokol ile birleştirilip detaylandırılmıştır.
Böylece özellikle spermatositlerin ve golgi fazındaki round spermatid (bu hücre grupları ayırd edilebilen bir akrozomal vezikül içermezler) hücrelerini ayırd edebilmek mümkün olmuştur. Bunların arasında reaksiyon veren hücreler (spermatosit/ round spermatid) hücre boyutlarındaki farklılıklar ile kolaylıkla farkedilebilir. Bu bilgiler, spermatidlerin taze preparatlardaki çok daha zor ayrımının yapılması sırasında yardımcı olurlar, hücrelerin yardımcı üreme tekniklerinde sperm bulunamadığı durumlarda kullanılabilmesi için bu bilgi ve tecrübe altın standarttır. Elongated spermatid tanımlaması round spermatid  ve elongating hücrelerine göre çok daha kolaydır. Farklı hastalar arasında spermatogenetik arrest düzeyleri konusunda bir tanımlama yapabilmek için her örnekteki spermatid formasyonları histolojik ve morfolojik yapılarına göre betimlenmelidir.

Hücrelerin sınıflandırılmasına çok genel olarak şu sınıflandırmaların belirlenmesi gerekmektedir:
Round spermatid (yuvarlak spermatid hücreleri)
Elongating spermatid (elonge olmakta olan)
Elongated spermatid (elonge olmuş olan)
Mature Elongated spermatid (Olgun elonge olmuş spermatid)
Bu sınıflandırma standart tüp bebek laborotuarlarında bulunan ve Hoffman kontrast optik sistemine sahip inverted mikroskop yardımı ile veya daha ayrıntılı olarak transmission elektron mikroskop (TEM) ve konfokal lazer inceleme tekniğine sahip mikroskop tekniği ile kullanılabilmektedir. ROSI işlemlerinde kullanılmakta olan ve en düşük gebelik başarısına sahip grup Sa1 düzey hücre grubudur . Spermiogenetik başarısızlığın söz konusu olduğu hastalardan elde edilir, düşük reprodüktif kapasitesi söz konusudur ve geçirdikleri apoptozis sonucu oosit aktive edici faktörleri edinememişlerdir.

Normal spermiogenezi tamamlamış hastaların bu düzeydeki round spermatid hücrelerinde de bu durumdan söz etmek mümkündür. Tesarik’in 1998’de gerçekleştirdiği round spermatid in vitro maturasyon çalışmalarında Sa1 hücrelerinde gelişim gözlenmiştir. Morfolojik olarak bir değişim gözlenmesine rağmen fertilizasyon kapasitesinin bu çalışmada %22’den %52’ye yükselmesi mümkün olmuştur. Bu tip round spermatidlerle enjekte edilen oositlerde döllenme  sonrası iki pronükleus yerine tek bir büyük nükleus gözlenir. Bu yapı, iki pronükleusun birleşmesinden oluşmuş tek bir singamik nükleus görünümündedir. ROSI olgularında nüklear zamanlama ICSI işleminden farklıdır ve bu nedenle oositlerin daha sık aralıklarla gözlenmesi gereklidir. Çünkü, ICSI işleminden 8-10 saat sonrası pronükleus gözlendiği durumlar olmuştur. Fertilizasyon kontrolünde iki ayrı pronükleus izlenmeyen hücrelerin prematür kondensasyon gösteren spermatid nedeni ile yalnızca dişi pronükleusu yansıtabildiği ise diğer bir görüştür.

Grade I: Round spermatid (yuvarlak spermatid hücreleri)
Sa1: Pürüzsüz yüzeye sahip spermatid çekirdeği çevreleyen küçük hacimli sitoplazma, yaklaşık 8 – 10 mm çapa sahip olup yoğun bir nükleus yapısına sahiptir. Nükleus periferinde ileride akrozomu oluşturacak olan bir akrozomal vezikülü bulunur.


Grade I: Sa1

Sa2: Sa1 spermatid formuna çok benzemekle birlikte akrosomal vesikül belirgin bir şekilde gözlenir .


Grade I: Sa2

Grade II: Elongating spermatid (elonge olmakta olan)
Sb1: Yuvarlak baş ve yuvarlak çekirdek yapısına sahip olmasına rağmen elongasyon başlar. Akrosomal vesikül nükleer yüzeyin üst kısmında ortaya çıkar.


Grade II:Sb1

Sb2: Yuvarlak baş içinde akrosomal vesikül ile plasma zarından ayrılmış ve sitoplazmanın üst kısmına doğru ilerlemiş oval çekirdekleri vardır.ortaya çıkar. Elongasyon artık artmıştır. Sitoplazma sadece protüzasyona başlamış plan akrosomal vesikülün üst kısmında yoktur.


Grade II:Sb2

Grade III: Elongated spermatid (elonge olmuş olan):
Sc1: Yuvarlak baş ve uzun çekirdeğe sahip bu spermatidin  gelişim düzeyinde mitokondrial boyun oluşumu başlar.


Grade III: Sc1

Sc2: Baş ayırdedici şekilde uzamaya başlar .Sitoplazmik yoğunluk çekirdek çevresindedir.


Grade III: Sc2

Sc3: Bu aşamada hücrenin elonge olmuş, akrozomal kep oluşumu stoplazmadan dışarı tamamen protrüzasyon gösterir.


Grade III: Sc3

Grade IV: Mature Elongated spermatid (Olgun elonge olmuş spermatid):
Sd1: Başın uzun olarak izlendiği bir gelişim evresidir. Sitoplazmik yoğunluk akrosomal vesikülün alt kısmına doğru yoğunlaşmıştır.


Grade IV:Sd1

Sd2: Sitoplazmik yoğunluk çekirdeğin alt kısımlarında görülmeye başlar.


Grade IV: Sd2

Sd3: Sitoplazmik yoğunluk seviyesi artık çekirdeğin alt kısmındadır.


Grade IV: Sd3

Sd4: Sitplazmik yoğunluk manşet şeklinde ayırd edilir, spermatidin boyun kısmında bir droplete dönüşmeye başlar.