MOLEKÜLER GENETİK

1-MOLEKÜLER SİTOGENETİK TANIMLAMA
Moleküler sitogenetik inceleme için, kromozomlar çeşitli floresan boyalarla işaretlenip analiz için hazırlanır. Bu yönteme FISH (FluorescenceInSituHybridization) adı verilir. Kromozom bölgeleri kullanım amaçlarına göre farklı bölgelerinden işaretlenip analiz edilebilirler. FISH yönteminin avantajı kromozomlar elde edilmeden direk hücre çekirdeğine uygulanabilmesidir.

FISH ANALİZİ İLE TANIMLAMA YAPILABİLECEK ÖRNEK TANIMLAMALARI:
Periferik Kan

Fetal Kan (Bebek kordon kanı)

Amniyon

CVS (KoryonVillus Biyopsi)

Tahliye Materyali (Düşük Materyali)

Doku, cilt biyopsisi

Sperm

Blastomer yadatrofektoderm(Embriyo hücresi)

FISH UYGULAMALARI:
Mikrodelesyon sendromları için hücre kültüründen spesifikproblarla FISH analizi (kan, cilt dokusu)

Prader-Willi/Angelman Sendromu

DiGeorge Sendromu

Williams Sendromu

Retinoblastoma

BCR/ABL

Amnion sıvısından spesifikproblarla FISH analizi

Amnion sıvısından FISH ile hızlı anöploidi incelemesi

Marker kromozomlar için FISH analizi

Blastomerlerdeanöploidi testi ve translokasyonlar için spesifikproblarla FISH analizi (Preimplantasyon genetik tanı)

Sperm FISH analizi

Sperm FISH
Gebelik kayıplarına, tekrarlayan implantasyon başarısızlıklarına ve anormal doğumlara sebep olabilen bazı kromozomal anormalliklerin babadan kaynaklan önemli bir bölümü sperm üretim  aşamasındayken de novo yani geri dönüşümsüz yeni oluşum olarak gerçekleşir.  Normal şartlarda her bir sperm hücresi tek set kromozom içeren haploid yapıda olmalıdır.  Anormal durumlarda, sperm bir veya daha fazla kromozomu fazladan yada eksik taşıyor olabilir (anöploid), yada fazladan bir kromozom seti taşıyor olabilir (diploid). Bu gibi durumları belirleyebilmek için sperme FISH işlemi (Floresan boyalarla inceleme) uygulanır. Bu işlemde 13, 18, 21, X ve Y kromozomları incelenir. Eğer baba adayı translokasyon (kromozomlar arası yeniden düzenlenmeler ve yer değiştirmeler) taşıyıcısı ise bu translokasyona katılan kromozomlara yönelik özel FISH işlemi de uygulanabilir. Bu yöntemle, kişinin dengesiz gamet yüzdesi hesaplanabilir ve oluşacak embriyolarındaki dengeli-dengesiz oranı hakkında fikir sahibi olunabilir. 2000 adet sperm incelenerek anormal sperm yüzdesi belirlenir.

2-TEK GEN HASTALIKLARI
İnsan genom projesinin sonuçlanmasından sonra insan genomunda yaklaşık 30 binin üzerinde gen bulunduğu saptanmıştır. Her bir genin oluşturabileceği problemlerden kaynaklanan hastalıklara  tek gen hastalıkları (single gene disorders)denmektedir ve kalıtsal olarak sonraki nesillere aktarılma riski oluşturmaktadır.

Tek gen hastalıklarının tanıları moleküler tetkiklerle saptanmaktadırlar. Bu hastalıkların ortaya konulması insanda çeşitli evrelerde yapılabilmektedir.

Postnatal Tanımlama: Doğum sonrasında yapılan incelemelerdir

Prenatal Tanı: Doğum öncesinde (gebelikte) anne karnındaki bebeğe yapılan incelemelerdir

Preimplantasyon Genetik Tanı: Anne rahmine yerleştirilmeden önce embriyolara yapılan incelemelerdir

AKDENİZ ANEMİSİ
Akdeniz Anemisi (Beta-talasemi), adından anlaşıldığı gibi akdenizde yer alan bölgelerde en sık rastlanan tek gen hastalıklarının başında gelir, bu nedenle ülkemizdede en çok görülen kalıtsal hastalıklardan biridir. Hastalık geninin Türkiye’deki ortalama görülme sıklığı % 4–5 kadardır, fakat özellikle güneyde bazı bölgelerde bu oran % 20’lere kadar tırmanabilmektedir. Beta-talasemi, otozomal resesif (genetik problemin  hem anne hem babada taşındığı tipte) kalıtım gösterir. Akraba evliliklerinin yaygın olduğu bölgelerde hastalığın görülme sıklığı artmaktadır.

Beta-talasemi geni 11 numaralı kromozomun üzerinde yer almaktadır. Gen üzerinde oluşacak mutasyonlar beta-globin üretimini azaltır veya sentezlenmesini tamamen  durdurur. Hemoglobin üretimin azalması sonucu hastalarda mikrositikhiperkromik anemi oluşur.

Beta-talasemi tanısı, yapılan  kan testleri ile ortaya  konulur. Periferik yaymada çekirdekli alyuvarların varlığı, hemoglobin elektroforezi sonucu hemoglobin A seviyesinde gözlenen  düşük miktar hastalığın başta gelen bulguları olarak göze çarpar. Hastalığın tespit edilmesinden sonra mutasyonun moleküler teknikler ile tanımlanması çok büyük önem kazanır. Beta-talasemi için moleküler tanı, beta-globin geninin tümüyle dizilenmesiyle (Tüm Gen Analizi- wholegenomeanalysis) ortaya konulmaktadır. Bu tanı yöntemi hem bireylerdeki mutasyonun tespit edilmesini, hem de anne karnındaki fetüsten alınacak örnekle beta-talasemi mutasyonlarının tespitini sağlar.

Akdeniz anemisi (talesemi taşıyıcısı anne ve baba sağlıklı bebek sahibi olmak istediklerinde Preimplantasyon Genetik Tarama ve Tanı (PGT)  merkezimizde yapılmaktadır.

ORAK HÜCRE ANEMİSİ
Bilindiği gibi, Alyuvarlar kanı oluşturan hücrelerdir. Alyuvarlar kana rengini veren hemoglobin maddesini taşımaktadırlar. Hemoglobinler ayrıca oksijenin taşınmasında rol almaktadırlar. Hemoglobinin birden fazla çeşidi bulunmaktadır. HbF bebeklerde, HbA normal erişkin bir insanda ve HbS orak hücre anemisi hastalarında bulunmaktadır.

Orak hücre anemisi hastalığı otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. Beta-globin gen dizisinin, 6 numaralı bölgesindeki  nokta mutasyonu (pointmutation) sonucu glutamik asit yerine valin kodlanması sonucu HbS oluşur. Bu kişilerin alyuvarları oksijen miktarında düşüş kaydedildiği takdirde, farklılaşır ve formudaorak şeklini alırlar. Alyuvar miktarı bu hastalarda fazla olmasına rağmen yaşam süresi sınırlıdır.

Hastalığın tespiti moleküler seviyede gerçekleştirilen tetkiklerle yapılmaktadır. Bir çok tanımlama çalışmasında  orak hücre anemisi için moleküler tanı beta-globingeninindeki COD 6 bölgesinin dizilenmesiyle konulmaktadır. Bu tanı yöntemi hem bireylerde mutasyon tespit edilmesi için hem de anne karnındaki fetüsten alınacak örnekle orak hücre anemisinin tespitini sağlar. Gebeliğin 10. haftasından sonra Koryonvillüs biyopsisi (CVS) veya 15. haftasından sonra yapılacak amniosentez yardımıyla olabilir.

Orak hücre anemisi taşıyıcısı anne ve baba sağlıklı bebek sahibi olmak istediklerinde Preimplantasyon Genetik Tarama ve  Tanı merkezimizde yapılmaktadır.

AİLESEL AKDENİZ ATEŞİ (FMF)
Ailesel Akdeniz Ateşi (FMF) tekrarlayan ateş ve periton, sinoviyum veya plevra enflamasyonubelirtileri ile kendini ortaya koyan otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. Karın ağrısı en belirgin özelliğidir.  Karın zarında, eklemlerde ve akciğer zarında oluşan iltihaplanma ağrı ve ateşe neden olur. Kan testlerinde yüksek eritrosit sedimentasyonu, lökosit sayısında ve fibrinojen miktarında artış gözlenir. FMF’in bilinen tek tedavisi, Kolşisin isimli ilaçtır. Kolşisin, ateş ve karın ağrısı ataklarının sıklığını ve şiddetini azaltmaktadır.

FMF hastalığıyla ilgili olan tek gen MEFV genidir. MEFV geni 16 numaralı kromozomda yer almaktadır. Türk toplumunda V726A, M694V, M694I, K695R, M680I, A744S, E148Q ve R761H mutasyonları MEFV geninde en sık rastlanan mutasyonlardandır. FMF hastalığının moleküler tanısı talasemide olduğu gibi tüm gen analizi ile yapılmaktadır. Genetik merkezlerinde  mutasyonlarının %80 nin yer aldığı exon 2 ve exon 10 bölgeleri tüm gen taramasıyla incelenmektedir.

Bireylerde FMF analizi yapılmasının yanı sıra gebelik esnasında CVS veya amniosentez yöntemiyle alınacak örneklere de FMF analizi yapılmaktadır. Ayrıca FMF taşıyıcı anne baba veya anne babadan herhangi birinin hasta diğerinin taşıyıcısı olması durumunda sağlıklı bebek sahibi olmak istediklerinde FMF için Preimplantasyon Genetik Tanı merkezimizde yapılabilmektedir.

KİSTİK FİBROZİS
KistikFibroz dünya genelinde sık rastlanan kalıtsal hastalıklardan bir tanesidir. Kistikfibroz, solunum ve sindirim sisteminin yüzeyini kaplayan hücrelerinde sodyum ve klor iyonlarının taşınmasını sağlayan proteini üreten CFTR geninde oluşanmutasyonlar sonucu ortaya çıkar. Mutasyonlar sonrasında mukus tabakası daha yoğun bir hal alır ve akciğerlerin tıkanmasına ve enfeksiyon gelişmesine, pankreasın tıkanarak sindirim enzimlerinin bağırsağa ulaşımının engellenmesine neden olur.

Kistikfibroztransmembran iletim düzenleyicisi (CFTR) geni 7 nolu kromozomda yer alır. CFTR geninde yaklaşık 1400 tane mutasyon tespit edilmiştir. Mutasyonların oluşturacağı etkiler birbirlerinden farklıdır. Bazı mutasyonlar CFTR proteininin normalden küçük ya da yetersiz miktarda üretilmesine yol açarken, diğerleri proteinin düzenlenmesini ya da hücre zarındaki lokalizasyonunu engellerler. Bazı mutasyonlar KistikFibroz hastalığına neden olurken CFTR geninde oluşan bazı mutasyonlar erkeklerde kısırlığa sebep olur. Bu mutasyonlar testislerden sperm taşıyan kanalların birinin (CUAVD: CongenitalUnilateralAbsence of VasDeferens) veya her ikisinin de (CBAVD: CongenitalBilateralAbsence of VasDeferens) gelişmemesine neden olur. Testisler normal gelişmiş ve cinsel fonksiyonlar normal olmasına karşın vasdeferens gelişmemiş olması nedeniyle erkek üreme sistemindeki spermler meniye taşınamaz.

KistikFibroz hastalığının moleküler tanısı dünya genelinde en yaygın olan 33 mutasyona ek olarak polyT bölgesi PCR-OLA (polimeraz zincir reaksiyonu- oligonucleotideligationassay )  yöntemiyle taranmaktadır. Türk toplumunun çok heterojen olmasından nedeniyle kistikfibroz tanısı kesin koyulan hastalarda mutasyon sayısı genetik dizileme ile ile 500 e kadar çıkarılmaktadır.

Kistikfibroz hastalığının görülme sıklığı yüksek olduğundan Kistikfibroz mutasyonu tespit edilen CBAVD hastalarının ayrıca eşlerinde de gen taraması yapılmalıdır. Eşinde de kistikfibroz saptanan hastalara Preimplantasyon Genetik Tanı veya gebelik sonrası prenatal tanı işlemlerini merkezimizde uygulamaktayız.

Y-KROMOZOMU MİKRODELESYONLARI
Erkek cinsiyetinin belirlenmesinde rol alan Y kromozomu üzerinde sperm oluşumunda ve gelişiminde yer alan genler bulunmaktadır. Y kromozomunun p kolunda yer alan bu genlerin bulunduğu bölge AZF (Azoospermiafactor) bölgesi olarak adlandırılır. Bu bölgedeki genler 3 grup olarak adlandırılmıştır. AZFa, AZFb ve AZFc bölgeleri.

Y delesyonları özellikle 1 milyon spermatozoa/ml altında olan hastalarda tespit edilmektedir. En sık rastlanan delesyonlarAZFc (yaklaşık %60) bölgesindedir. Bunu AZFb ve AZFb+c veya AZF a+b+c bölgeleri (%35) izlemektedir. AZFa bölgesinde görülen delesyonlar oldukça nadirdir (%5). Delesyonlar diğer androlojik bulgularla birlikte (varikosel, kriptorşidizm, hipogonadotropikhipogonadizm, obstruktifazoospermi) görülme olasılığı (%7) yönünden bağımsızdır. AZFa veya AZFb bölgelerinin tamamının (komplet) delesyonuSertoli Cell-only (SCO) ve spermatogenetikarrestpatolojik sonuçları ile ilişkilendirilir. Bu bölgelerin parsiyeldelesyonu veya AZFc bölgesinin parsiyel veya kompletdelesyonuhipospermatogenez (oligospermi) ile Sertoli Cell-onlysendromu arasında değişken fenotiplerle uyum gösterir.

Y kromozomu mikrodelesyon taraması diagnostik, prognostik ve koruyucu önleme sahiptir. Azospermik hastalarda rastlanacak kompletAZFa veya AZFbdelesyonlarıtestiküler sperm elde edilmesi açısından negatif prognostik değere sahiptir.Bu silinmenin zaman içerisinde artabilme olasılığına karşı, bulunacak hücrelerin dondurılşması hastanın fertilitesinin korunumunu sağlamak açısından  çok büyük önem taşımaktadır.

Y kromozomu mikrodelesyonları merkezimizde moleküler tekniklerle tanımlanmaktadır. AZF bölgesi için 28 farklı STS bakılmaktadır.



TROMBOFİLİ PANELİ
Trombofili Panelinde toplam 4 farklı bölgeye bakılmaktadır.

Faktör V: Faktör V kan koagülasyon (pıhtılaşma)  sistemindeki en önemli proteinlerden biridir. Faktör V aktive edilmiş protein C (APC) ‘ninkofaktörü olarak fonksiyon yapar. Faktör V Leiden mutasyonu otozomal dominant olarak nesiller arası iletilir. Bu mutasyon varlığında faktör V’in APC tarafından inaktive edilmesi engellenir ve kanda yoğun pıhtılaşması meydana gelir. Tromboz tehlikesi doğum kontrol hapı kullanımı, sigara, ileri yaş ya da pıhtılaşma sistemini etkileyen diğer tromboz etkenleri (Prothrombin 20210) gibi risk faktörlerinin varlığında çok daha fazla artar.

Faktör II (Prothrombin 20210A): Prothrombin 20210 mutasyonu Faktör V polimorfizminden sonra tromboz oluşumuna en sık neden olan polimorfizimdir. Tromboz, kandaki protrombin miktarının artmasıyla ortaya çıkar.

MTHFR enzimi protein ve polyamine sentezi ve metilasyon reaksiyonları için gerekli olan metil alış-verişinde etkindir. MTHFR varyantları nöral tüp defekti, homosisteinemi, erken yaşta kalp damar hastalığı, erken yaşta venöztromboz ortaya çıkma riskini arttırır.

MTHFR C677T: MTHFR C677Tnin homozigot olduğu durumlarda yüksek plazma homosistein ve düşük folat seviyesi gözlenmektedir. Enzim aktivitesi % 30 civarlarındadır.

MTHFR A1298C: MTHFR A1298C, homocysteine ve plazma folatkonsantrasyonunu etkiler.

Bu testlerin uygulama koşulları:
TEST ÖRNEK SÜRE BİLGİ
Beta- Talasemi -EDTA’lı Tüpe 3-5ml kan 15 gün Beta-globin geni Exon1 ve 2 bölgeleri dizi analiz yöntemiyle incelenir.
Orak Hücreli Anemi -EDTA’lı Tüpe 3-5ml kan 15 gün Beta-globin geni COD6 bölgesi dizi analiz yöntemiyle incelenir.
Ailesel Akdeniz Ateşi (FMF) -EDTA’lı Tüpe 3-5ml kan 15 gün MEFV geni Exon 2 ve 10 bölgeleri dizi analiz yöntemiyle incelenir.
KistikFibroz
(34 Mutasyon)

EDTA’lı Tüpe 3-5ml kan 7–10 gün CFTR genindeki 33 mutasyon + polyT bölgesi PCR-OLA yöntemiyle incelenir.
KistikFibroz -EDTA’lı Tüpe 3-5ml kan 30–45 gün Türk toplumunda en sık görülen CFTR mutasyonları dizi analiz yöntemiyle taranır.
Y-Kromozomu Mikrodelesyonları -EDTA’lı Tüpe 3-5ml kan 10–15 gün Y kromozomundaki 28 STS bölgesi Floresan PCR yöntemiyle çoğaltılarak Fragman analiziyle incelenir.
Trombofili Paneli
(FV, FII, MTHFR677, MTHFR1298)

-EDTAlı Tüpe 3-5ml kan 10–15 gün İlgili gen bölgeli multiplex PCR ile çoğaltılarak mutasyonlar minisequencing metoduyla incelenir.