Oosit toplanması işlemi (OPU; oocyte pick-up) sırasında tüm oositlerin en kısa sürede elde edilmesi, elde edilen kumulus-korona-oosit kompleksinin maturasyon seviyesinin değerlendirilip inseminasyon için uygun bir ortam sağlanması çok önemlidir.

Oosit toplama İşlemi

Oosit toplanması işlemi transvajinal ultrasonografi eşliğinde genel anestezi altında yapılır.İşlem için tek yada çift lümenli steril iğneler kullanılmaktadır. İşlem sırasında oosit kalitesini ve embriyo gelişimini etkileyebilecek olan ısı, osmolarite ve pH değişimlerini en aza indirmek için, oositler en kısa zamanda kültür mediumuna alınıp inkübatöre kaldırılmalıdır. Oosit toplama işleminde kullanılan aspirasyon pompası ısıtıcı bloğa sahip olmalı ve toplanan folikül sıvısı ve foliküllerin içerisinin yıkanması için kullanılan yıkama mediumu sürekli 37°C’de tutulmalıdır. Oosit toplanması sırasında, foliküler sıvı içeren tüplerin  ulaşımı için laboratuar ile oosit toplama odası arasındaki kapı açık bırakılır. Foliküler sıvıda oosit aranması laminar air flow altındaki stereomikroskop yardımı ile gerçekleştirilir.

Mümkün olan en kısa sürede, oositler karşılama mediumundan alınıp birincil kültür ortamına  alınmalıdır. Foliküler sıvıda başka oosit olup olmadığı kontrol edilerek kanlı follikül sıvısı bulunan petri kapları atılır. Bu uygulamalar, oosit toplama işlemi bitinceye kadar tekrar edilir. Oosit toplama işlemini yapan klinisyene, son gelen örnekte oosit olup olmadığı, oosit maturasyonu ve toplanan toplam oosit sayısı bildirilmelidir.

Oosit toplama işlemi bittikten sonra insülin enjektörleri yardımı ile oosit karşılama mediumundaki tüm oositler, petri kabın eritrosit içermeyen bölgesine taşınır ve toplam oosit sayısı belirlenir. Daha sonra oosit  kumulus diseksiyonu gerçekleştirilir. Bir oosit için diseksiyon süresinin 15 saniyeyi geçmemesi gerekmektedir. Diseksiyon tamamlandığında inkübatörde bulunan ve birincil kültür mediumu içeren  petriye alınarak altına dikkatlice isim yazılır.

Oosit-Kümülüs kompleksi maturasyon değerlendirmesi
İşlemler bittiğinde oosit maturasyonu değerlendirilir. Oosit maturasyonu mutlaka inverted mikroskop altında yapılmalıdır. Bu aşamada maturasyon değerlendirmesi kesin olmayabilir ancak genel görünüm hakkında fikir sahibi olmak ve inseminasyon zamanını belirlemek açısından önemlidir. Maturasyon değerlendirmesi oositin çevresini saran korona/kümulus kompleksinin  radial yayılımına göre yapılır.

KONVASİYONEL IVF
Oositlerin sperm ile insemine edilmesinden önce olgunun dosyası yeniden gözden geçirilir. İnfertilite nedeni, infertilite süresi, önceki ART denemeleri, daha önce değerlendirilen semen örneğine ait  sperm parametreleri, erkek veya kadında sperm antikorlarının olup olmadığı değerlendirilir. İşlem günü alınan sperm parametreleri ve morfoloji indeksi incelenir. Daha önce IVF kararı alınmasına etken olan sperm parametreleri işlem günü değerlendirme ile uyumlu bulunmuş ise ve maturasyon değerlendir mesine göre en az on adet matür görünümlü oosit toplanmış ise IVF işlemi yapılır.

Androloji laboratuarında uygun şartlarda ve çift kontrollü hazırlanmış ve ağzı parafilm ile kapatılmış olan sperm örneği alınır. İnseminasyon, OPU işleminden en erken 4, en geç 6 saat sonra gerçekleştirilir. İnseminasyon için Tip I veya Tip II kumulus mass yapısına sahip olan oositler seçilir. Pastör pipeti ile her bir droplete ortalama 2 adet oosit yerleştirilir. Her droplette ayrı steril uç kullanılarak spermler mikropipetör yardımı ile oosit çevresine insemine edilir. Sperm inseminasyon işlemi bittikten sonra inverted mikroskopta sperm yoğunluğu kontrol edilir. İşlem yapılan kapları inkübatör kapağında olgunun soyadının yazılı olduğu bölüme yerleştirilir.

MİKROENJEKSİYON
ICSI işlemi için Kumulus ve Korona Hücrelerinin Temizlenmesi:
Ooositlerin maturasyonuna karar verebilmek ve de ICSI işlemini gerçekleştirebilmek için oositlerin etrafındaki kumulus ve korona hücrelerinin uzaklaştırılması gerekmektedir.Bu işlemin OPU’dan sonra minimum 2 saatlik inkübasyon süresi sonrası yapılması gerekmektedir. temizlenmesi sağlanır.

Oosit morfolojisi değerlendirme gerek laboratuar içinde, gerekse laboratuarlar arasında, belirli standartları da olsa kişiden kişiye değişebilme olasılığının yüksek oluşu nedeni ile çok dikkatli uygulanması gereken bir işlemdir. Günümüzdeki yaygın kanı, IVF veya ICSI işlemi için kullanılan spermden çok, işlem uygulanan oositin morfolojisinin önem taşıyor olmasıdır.

Olgun bir oosit yuvarlak (yaklaşık 100mm büyüklüğünde), açık renkli parlak ve homojen granülasyon gösteren sitoplazmaya ve düzgün yüzeyli bir oolemmaya sahip olmalıdır. Zona pellusidası; yaklaşık 14-15 mm kalınlığında, kesintisiz, oosite bakan yüzü daha homojen ve tüm oosit yüzeyinde eşit kalınlıktadır. Perivitellin aralık ise döküntü içermeyen, düzgün ve I. Kutup cisimciğinin bulunduğu bölgede hafif genişlemiş diğer bölgelerde aynı genişlikte olmalıdır.

Değişik gruplar bugüne kadar yaptıkları çalışmalarda oosit morfolojisinin döllenme, embriyo gelişimi ve gebelik üzerine olası etkilerini araştırmışlardır. Bazı araştırmalar oosit morfolojisinin fertilizasyon ve klivaj oranları üzerine bir etkisi olmadığı sonucuna varırken, bazıları granüler oositler ve sitoplazmik anormallikler (düz endoplazmik retikulum, refraktil cisimcikler ve vakuoller) içeren oositler kullanıldığında implantasyon ve gebelik oranlarında azalmaya sebep olduğunu göstermiştir.  Oluşum nedenleri ile oositin maturasyonu veya oluşturacağı embriyonun ileri gelişimi üzerine etkisi tam olarak anlaşılmamasına rağmen konvansiyonel IVF programlarında refraktil cisimcik içeren oositlerde fertilizasyonda kötü prognoz gözlenmiştir. Hem matür hem de immatür oositler refraktil cisimcik içerebilirler ve hastadan bir sonraki siklusunda da refraktil cisimcik içeren oosit elde edilme olasılığı yüksektir. Gelişim potansiyeli açısından uygun olmayan  ve dismorfik bir oositten elde edilen embriyonun gelişimin ileriki aşamalarında hem vivo hem de in vitro ortamda gelişimini durdurma şansı yüksektir. yakın tarihte yaptıklan bir araştırmalarında gösterdikleri gibi ciddi sitoplazmik organizasyon bozukluğu içeren M II safhasındaki oositler normal gruptakilere göre daha düşük bir hücre içi pH ve ATP içermektedir ve bununla beraber aynı grupta anöploidi ve kromozomal dağılım oranları da yüksek olarak bulunmuştur.

Yapılan son çalışmalar oosit morfolojisindeki anormalliklerin yüksek oranda multi-faktöryel olduklarını göstermektedir. Bunlardan ilki uygulanan kontrollü ovaryen sitimulasyon protokollerinin oosit üzerinde oluşturabileceği olumsuz etkilerdir. Yaygın olan kanı, stimulasyon olmaksızın atreziye uğrayarak elimine edilebilecek anormal yapıya sahip oositlerin kullanılan stimulasyon protokolü ile matür hale gelebilme olasılıklarının tedavi üzerinde olumsuz etki oluşturabilecekleri yönündedir. Çalışmalar, normal bir stimulasyon programı sonrası elde edilmiş insan oositlerinin %30’undan daha fazlasının sayısal kromozom anomalileri içerdiklerini ortaya koymuştur.

İkinci önemli etken, oositin maturasyon süresi boyunca içinde bulunduğu ve gelişimini tamamladığı ortam ve hormon parametreleridir. Hipoksik bir folikülden elde edilen oositler ile kötü embriyo gelişimi sergileyen oositler arasında bir bağlantı olduğunu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Hormonlar arasında da  östrojen ve progesteron değerleri sitoplazmik ve nükleer maturasyon için çok önemlidir. Ayrıca foliküllerin uyarılmasında kullanılan gonadotropin preparatları da dikkat edilmesi gereken diğer bir hormonal parametreyi oluştururlar. Yapılan araştırmalar hipofiz desensitizasyonu sonrası kullanılan saf FSH preparatlarının elde edilen oositlerdeki

Mikroenjeksiyon işlemi (ICSI)
ICSI işlemi tek bir spermin oositin stoplazmasının içine enjekte edilmesi anlamına geldiği için, bu işlemde  normal fertilizasyon işleminde izlenen, spermin kumulus hücreleri arasından geçip oosite ulaşması, zona pellusidayı delmesi ve sitoplazma içine girmesi sırasında oluşan karmaşık olaylara gerek kalmamaktadır. ICSI tekniği ilk olarak Hiramoto’nun deniz kestaneleri ve daha sonra Lin’in fareler üzerinde yapmış olduğu çalışmalarla başlamıştır. Tekniğin ilk kullanılmaya başlandığı zamanlarda yüksek oranda oosit zararı ve  dejenerasyon izlenmekte ve buna bağlı olarak enjekte edilen fare yumurtalarının sadece %30’u yaşamaya devam edebilmekteydi. ICSI sonrası ilk canlı doğum sığırlarda elde edilmiştir. İnsanda ise ICSI sonrası ilk gebelik 1992 yılında elde edilmiştir.

Normal fertilizasyonda kendiliğinden oluşan oosit aktivasyonunu ICSI işleminde sağlamak ve buna bağlı olarak male pronukleusun oluşmasını indüklemek için farklı yöntemler vardır. Bunlardan birisi ICSI işleminden yaklaşık 10 dakika önce ya da ICSI işlemi sırasında bir miktar stoplazmanın ICSI pipetinin içine aspire edilmesidir. Bir diğer yöntem ise oositlerin kalsiyum iyonofor içerisinde bekletilmesidir.

Mikroenjeksiyon Hoffman modülasyonu olan inverted mikroskobun ısıtıcı tablası üzerinde yapılır. X400 büyütme kullanılır. Mikroskop hava akımı ve kapıdan uzak, vibrasyonu önleyen masa üzerine konmalıdır. Olguların daha önceden incelenmiş dosyaları, işlem günü  semen analizi sonucuna göre tekrar gözden geçirilir. İnfertilite nedeni, daha önce  mikroenjeksiyon işlemi yapılıp yapılmadığı, eğer yapıldıysa fertilizasyon oranı, elde edilen embriyo sayısı ve kalitesi gözden geçirilir. Sperm parametreleri değerlendirilir. Motilitesi çok düşük örneklerde ( <%1), 12-15 µm çapında bir mikropipet ile hareket eden spermler tek tek toplanarak oluşturulan bir rezervuar droplet içine bırakılır. Totale yakın immotil spermleri olan olgularda aynı gün ardışık semen örneği alınması toplam motil sperm sayısının artışına katkıda bulunmaktadır.

OPU işleminden yaklaşık 2 saat sonra oositlerin denudasyonu ve vakit kaybetmeden ICSI işlemine gidilmesi gerekmektedir. Mikroenjeksiyon işleminde morfolojik olarak normal görünümlü ve eğer mevcutsa motil spermler seçilir. Motil spermlerin, immobilize edilmiş  spermler kadar iyi fertilizasyon sağlamadığı bilinmektedir. Bu yüzden mikroenjeksiyon işleminde kullanılacak olan spermin immobilize olması gerekmektedir. Bu işlem ya mekanik yolla ya da laser kullanılarak yapılmaktadır. Mekanik yolla yapılan sperm immobilizasyonunda, mikroenjeksiyon pipetinin uç kısmı ile sperm boynuna yakın kısmından hafifçe immobilize  edilir ve kuyruğa doğru pipet ucu ileri geri kaydırılarak sperm kendi etrafında döndürülür. Sonunda ani bir hareketle kuyruğun kıvrılması ve sperm membranın zedelenmesi sağlanır. Sperm mikropipet içinde iken yağ içinden çıkmaksızın ilk oosit dropletine gidilir. Droplet içindeki oosit, holder ile hafifçe aspire edilerek sabitleştirilir. Enjeksiyon pipeti ile oositte rotasyon yapılarak polar body’nin yeri saat 12 hizasına gelecek şekilde tespit edilir ve oositin polar segmentini içeren granüler görünümlü alan belirlenir. Bu alan germinal vesikülün parçalandığı alan olarak tahmin edilmekte ve sonuçta birinci polar body’nin protrüze olduğu yer olarak düşünülmektedir. İşlem esnasında oositin ekvatoryal düzlemi ile yakalama pipetinin iç ağız açıklığı aynı düzlemde olmalıdır. Oositin alt kutbu petri kabın tabanına değmelidir. Enjeksiyon pipeti oositin saat 3 hizasına getirilir ve oolemmanın dış çizgisi ile aynı düzlemde olması sağlanır. Sperm yavaşça pipetin uç kısmına getirilir ve zona pellusida delininceye kadar aspirasyon yapılmaksızın ilerletilir. Oosit stoplazması içine ulaştırıldığında hafif bir aspirasyon yapılır.



Oolemmanın pipet içine yavaşça dolması ve spermin geriye doğru hareketlenmesi oolemma membranının aşıldığını gösterir. Yavaşça aspire edilen stoplazma ve sperm geri verilir. Pipet oosit içinden çıkarılırken hafifçe aspirasyon yapılarak oolemma açıklığı kapatılır ve sitoplazmik yapının sperm etrafını sıkıca sarması sağlanır. Bu işlem tüm oositlerde aynı sıra ile uygulanır. İşlem esnasında sperm ve oosit morfolojisi, mikroenjeksiyon ile ilgili tüm bilgiler sıra ile ICSI takip formuna kayıt edilir.

EMRİYO BİYOPSİ İŞLEMİ
Embriyo biyopsi, embriyonun, genetikte incelenen kromozomlar açısından, normal olup olmadığını, teşhis etmek amacıyla uygulanan bir yöntemdir. Embriyo biyopsi işlemi ile embriyonun transferi yapılmadan önce test edilmesi çiftlerin herhangi bir genetik hastalık taşıyıp taşımadığı hakkında bilgi veren önemli bir yöntemdir. Embriyodan biyopsiyle alınan hücre, genetik bölümüne iletilir. Genetik inceleme sonucunda tanımlanan normal embriyoların transferi gerçekleştirilir.

Embriyoloji laboratuarında, embriyo biyopsi işlemi embriyonun 3 farklı döneminde endikasyona bağlı olarak biyopsi uygulanır. 1- Zigot döneminde Polar body biyopsi, 2- 3. günde Blastomer biyopsi (embriyo biyopsi), 3- Blastosist döneminde Trofoektoderm biyopsi.Bu çalışmada polar body ve blastomer biyopsi sonuçları değerlendirmeye alınmıştır.

EMBRİYO TRANSFER İŞLEMİ
Embriyo Transfer işlemi , kateterin daha rahat yerleştirilebilmesi ve embriyoların rahim içersinde nereye konulduğunun tam olarak izlenebilmesi için dolu mesane ile ultrasonografi kontrolü altında yapılır. İşlem ağrısızdır ve anestezi gerektirmez. Jinekolojik masada vajene spekulum yerleştirildikten sonra vajen ve rahim ağzı steril serum veya özel sıvılar ile temizlenir.İnce bir kateter yardımı ile embriyolar endometriumun en uygun bölgesine bırakıldıktan sonra katater yavaş bir şekilde geri çekilir.Bu işlem yapılırken rahimde kasılmalara yol açmamak için katater rahim boşluğunun fundus kısmına değdirilmemelidir. Transfer işlemi tamamlandıktan sonra embriyoların hepsinin verildiğinden emin olmak için embriyolog tarafından katater kontrol edilir. Transfer edilecek embriyo sayısı kadının yaşı, ve daha önceki başarısız IVF denemeleri göz önünde tutularak yapılmaktadır. En iyi kalitedeki embryolar.