Sperm Morfolojisinin Infertiliteye Etkileri

Son 20 yıl içerisinde sperm morfolojisinin yardımcı üreme merkezlerinde günlük değerlendirmelerde pratik ve klinik yönde büyük önem taşıdığı farklı yayınlarla ortaya konmuştur.Sperm fonksiyonunu değerlendirmek için pek çok farklı boyamalar içeren  testler geliştirilmiştir.Bu testler çok detaylı, uygulaması güç, standart orak her laboratuvarın kullanımına uygunluk göstermeyen özellikler taşıdıkları gözlenmiştir. Bununla birlikte , konvansiyonel semen analizi detaylı bir morfolojik değerlendirme ile kombine edildiğinde erkek infertilite potansiyelinin araştırılmasında en önemli test haline gelmiştir.Böyle ayrıntılı bir değerlendirme ile sperm fonksiyonunu yansıtan çok değerli bilgiler edinilebilinir ve özellikle yardımcı üreme tekniklerinin kullanımında başarıyı arttırıcı farklı tekniklerin kullanılabilmesi için çalışmalar planlanabilinir. Sperm morfolojik değerlendirmesi, bir laboratuvarda uygun şekilde uygulanabildiği süreçte klinisyene kısa sürede önemli bilgiler sağlayabilmektedir.Sperm  kalitesinin en önemli parametrelerinden biri şeklidir. Semen analizinde değerlendirilen parametreler içerisinde spermin kapasitesi konusunda en önemli bilgiyi hareketlilik yanında sperm morfolojisi sağlamaktadır. Spermin morfolojisinin değerlendirilmesinde kullanılan iki temel değerlendirme kılavuzu  vardır. WHO kriterleri ve Kruger’in kesin değerleri.  Kruger’in kesin değerleri, morfolojik değerlendirme konusunda daha detaylı bir inceleme imkanı sağlaması nedeniyle en çok kabul gören tekniktir. Bu kriterlere göre yapılan incelemede spermin baş , boyun ve kuyruk bölgesine ait toplam 38 farklı anomali net bir şekilde tanımlanabilmektedir. Bu değerlendirme sonucunda %4’ün altında normal baş bulunması teratozoospermia olarak tanımlanır.

Bir sperm hücresinin normal olarak kabul edilebilmesi için sperm başı, boynu (orta parça), ve kuyruğu normal olmalıdır. Başın şekli oval olmalıdır. Başın boyu 4.0-5.0µm ve genişliği 2.5-3.5µm olmalıdır. Baş bölgesinin %40-%70’ini kapsayan iyi tanımlanmış bir akrozomal bölge olmalıdır. Orta kısım ince uzun ve genişliği 1µm den az, boyu baş uzunluğunun 1.5 katı ve başa aksiyal olarak bağlanmış olmalıdır. Kuyruk düz, düzgün biçimli, orta kısımdan ince, kıvrılmamış ve yaklaşık 45µm uzunlukta olmalıdır. Kruger kriterlerine göre %14 ve üzeri normal sperm olmalıdır.

Resim I: Olgun sperm morfolojisi

Sperm Morfoloji Değerlendirilmesinin Tarihsel Gelişimi:

İnsan spermatozoasının tanımlanıp ilk olarak çizimi 1677 tarihinde Antony Van Leeuwenhoek tarafından yapılmıştır. Carry 1916 yılında erkek infertilitesi ve sperm morfolojisi arasındaki ilişkiye dikkat çekmiştir.1925 yılında Williams ve Savage,1931 yılında Moench ve Holt  sperm başının morfolojisi ile üreme potansiyeli arasındaki ilişkiyi ortaya koymuşlardır.

1934 yılında ilk olarak yağ immersiyon objektifi ve sperm boyama solüsyonlarını kullanan Cary ve Hotchkiss, sperm anomalilerini sınıfladılar.1934 yılında Williams spermi morfolojik olarak ilk kez bölümlere ayırdı, baş, boyun,orta kısım ve kuyruk bölümlerini tanımladı, akrozomun varlığı ve nüklear bölgenin ayrımı baş kısmında kapladıkları alan  ilk kez ortaya kondu. Daha sonra gene Willims altı grupta sperm anomalilerini sınıflandırdı. 1951 yılında Macleod ve Gold ilk morfolojik sınıflandırmayı geliştirdiler. 1966 yılında Freund kuyruk anomalilerinide bu sınıflandırmaya ekledi.1971 yılında Eliasson, sperm başı ölçülerini saptadı ve sperm başında bu ölçülere göre ayrıca bir standizasyon sağlandı, ayrıca spermin bir bütün olarak ele alınması sağlandı.1980 yılında Dünya Sağlık Örgütü (World Health Organization –  WHO), piriform baş, orta kısım defektleri, sitoplazmik artık  ve kuyruk anomalileri 4 yeni grup olarak sınıflandırmayı zenginleştirdi. Ayrıca pin-head ve yuvarlak baş anomalileride ilave edildi.

1992 yılında üçüncü WHO kitabında semen değerlendirmesinde sperm morfolojisine daha fazla önem verildi, Strick Tygerberg Kriterleri daha fazla önem kazandı.Bu sınıflandırmada endoservikal kanalın proksimal ve distal kısımlarında bulunan sperm popülasyonlarının farklı morfolojik özellikler taşıyor olması yönlendirici faktör halini aldı.

Strıct Tygerberg Kriterleri:

İlk olarak Kruger ve Menveld isimli araştırmacıların dikkat çektiği bu kriterler, spermlerin vücut dışı ortamlardaki dölleme potansiyelini belirlemekte en sıklıkla başvurulan değerlendirme yöntemini oluşturmuştur.Strict Tygerberg kriterlerinin en önemli özelliği değerlendirmede standardizasyon sağlanmışolmasıdır.Sperm morfolojisi değerlendirilmesinde, değişik zaman aralıklarında yapılan değerlendirmeler sonucunda ,  aynı sonuçların ortaya konulabilmesi ve değerlendiren farklı kişilerin bu kriterleri dikkate alması nedeniyle ortak sonuca ulaşabilmeleri sağlanmıştır.Bu sınıflandırmanın strikt kriterler olarak anılmasının nedeni , borderline (sınır) formların da anormal olarak değerlendirilmeleri ve sadece tamamiyle kusursuz olanların normal olarak kabul edilmeleridir, lerleyen yıllarda yardımcı üreme tekniklerinde altın standart sayılabilecek sperm seçimlerinin tanımlanabilmesi için başlangıç oluşturan çalışmalardır.

Dünya sağlık örgütünün önceleri %50, daha sonra %30 olarak verdiği sperm morfolojisine ait alt sınıra karşılık ; Kruger  (T.F. Kruger) kriterleri ile bu alt sınırın önceleri %4  daha sonra %5 olduğu ortaya koyulmuştur.Sperm ile ilgili yapılan çalışmalar, özellikle zonapellucidaya (oositin en dış yüzeyindeki çeper) bağlanan spermlerin morfolojik değerlendirmesi sonrasında tanımlanmış ve bu çalışmalar Kruger kriterlerinin belirlenmesinde öncü olmuştur.Konu ile ilgili yapılan çalışmalar , tüp bebek  olgularında döllenme yüzdeleriyle ve fertil erkek popülasyonu üzerindeki çalışmalarla güçlenmiş ve sonuçta WHO kriterleri ile değerlendirilen sonuçların , Kruger kriterlerinden daha zayıf tanısal değeri olduğu gözlenmiştir.Sperm tarafından döllenmenin gerçekleşmesini sağlayarak embriyogenesis , hoploid genom, sentrozom ve oosit aktivasyonunu sağlayacak sinyalizasyon gibi kompleks gelişmelerin sadece sperm morfolojisi ile açıklanmasının mümkün olmamasına rağmen ; spermin yapısal bozukluk gösterdiği durumlarda gerek döllenme gerekse embryo gelişimi ilgili problemlere rastlanması, tüp bebek laboratuvarlarında spermin morfolojik değerlendirmesinin önemini arttırmıştır.Coetze ve Kruger 1998 yılında hazırladıkları meta analizde konu ile ilgili 18 yayını değerlendirip klasik IVF hastalarında , sperm morfolojisinin <%5 normal olarak saptandığı grupta gebelik oranları %15,2 olduğu halde >%5 grubunda %26,0 olarak gözlenmiştir.

Sperm Morfolojisinin Klinik Önemi:

Dünya Sağlık Örgütü (World Health Organizasyonu- WHO) infertilitesi tanımlamasını şöyle yapmıştır: En az bir yıl süreyle çiftlerin korunmasız olarak koitusta bulunmalarına karşın çocuk sahibi olamamalarıdır.WHO tarafından gerçekleştirilen çok merkezli araştırmaların sonucunda infertilite kliniklerine başvuran çiftlerin en az %48’ inde erkeğe bağlı nedenler bulunduğu ortaya konmuştur.

Şekil 1: İnfertilite nedenlerinin oransal gösterimi

WHO tarafından kurgulanan konvansiyonel semen analizinde, volüm, aglütasyon,ph, spermatogenetik hücre konsantrasyonu gibi parametrelerin yanında en önemli değerlendirme kriterleri sperm konsantrasyonu, motilite ve progresyon, morfoloji olarak belirlenmiştir.

Erkek fertilitesi değerlendirmesinde bir çok parametre değerlendirilmekle birlikte bugüne kadar tek başına fertilite potansiyelini belirleyen bir test henüz ortaya konulamamıştır.Strick kriterler eşliğinde değerlendirilen sperm morfolojisi bu yeterliliğe çok yaklaşmıştır.Klasik fertilite araştırmaları arasında yer alan postkoital test, sperm morfolojisi değerlendirilmesinin temellerini oluşturmuştur.

Morales ve arkadaşları, normal morfolojiye sahip spermlerin anormal spermlerden daha hızlı yüzmelerinden başka , daha yüksek dönme, flagellar hareket sıklığı ve flagellar hareket yüksekliğine sahip olduklarını göstermişlerdir. Kısaca önce morfoloji düzgün olmalıdır ve hareketlilikte buna bağlı olarak progresif şekilde artış gösterir.

Morfolojik Bozuklukların İnfertiliteye Etkisi:

Normal ve normale yakın morfolojiye sahip sperm hücrelerinin seçilmesi, infertilite tedavisinde son derece önemlidir. Örneğin; akrozom, spermin oosite penetrasyonu için gerekli enzimleri içeren önemli bir bölge olduğundan, akrozom anomalileri, sperm zona pellusida bağlanmasında sorun yaratmaktadır. Nukleus anomalileri, DNA içeriği hakkında bilgi verir. Bu da sağlıklı bir embriyo gelişimini etkiler.Sitoplazmik artık, spermin olgunlaşma sürecinde problem olabileceğini gösterir. Globozoospermiya, akrozomu olmayan spermatozoadır ve dölleme kabiliyeti sınırlıdır.Orta parça (mid-piece), mitokondrilerin olduğu önemli bir kısımdır. Buradaki anomaliler, enerji desteğinin noksanlığına neden olmaktadır. Bu durum sperm hareketlilik ve progresyonunu  direkt etkilemektedir.Spermin non-aksiyel orta parçaya sahip olması, progresif motilitesini düşürmektedir. Kuyruk, spermin hareketliliğini ve dikliğini sağlayan bölge olduğundan kuyruktaki anomaliler, sperm hareketini kısıtlayıcı etkiye sahiptir.

Normal Sperm Tanımlaması:

Menkveld adındaki araştırmacı, ilk kez normal olarak kabul edilebilecek sperm yapısını ve boyutlarını, mikron cinsinden kesin kriterlerle tanımlamıştır.Baş kısmında akrozom , postakrozom, ekvatoryal çizgi ve nükleus bulunmaktadır.

Resim 2:Normal morfolojiye sahip sperm görüntüsü

Daha sonra boyun ve mid-piece (orta kısım)gelir.Bu kısım en önemli bölümlerden biridir, çünkü burada spermlere motilite için gerekli enerjiyi verecek olan mitokondriler bulunur ve hareket mekanizmasından sorumlu kısım bulunur.Kuyruk kısmı da kalın olan ana kuyruk ve daha sonra daha ince olan uç kuyruk bölümlerinden oluşur.Sonrasında daha ince olan uç kuyruk bölümleri gelir.

Normal bir sperm morfolojisi şu şekilde olmalıdır:

a) Sperm Başı ovoid ve düzgün konturlu olmalı, iyi sınırlanmış bir akrosomal kılıf içermelidir.

b) Baş boyutları, 4-6 mikron X 2-3 mikron X1,5 mikron olmalıdır.

c) Akrosom, baş alanının %40-70’ini kaplamalıdır.Akrazom altında kalan bölümün konturları düzgün olmalıdır.

d) Boyun, mid-piece ve kuyruk anamolisi olmamalıdır.

e) Mid-piece silindirik ve baş ile aksiyel olmalıdır. Mid-piece eni 1 mikron, uzunluğu baş uzunluğunun 1,5 katı olmalıdır.

f) Mid-piece stoplazmik droplet (artık) içermemeli ve incelme yada abaksiyel bağlantı göstermemelidir.

e) Kuyruk uniform, mid-piece’den daha ince ve 45-55 mikron uzunluğunda olmalıdır.

Yardımcı üreme teknikleri programına alınan erkeklerde sperm morfolojisinin değerlendirilmesinde multiple anomali endeksi (MAI) kullanılır. Bu endeks her sperm için ortalama anomali sayısını vermektedir.

MAI =  Toplam değerlendirilen anomali sayısı/Toplam değerlendirilen anormal sperm sayısı

Hesaplanan MAI değeri 1,6 ve altında olmalıdır. Aksi takdirde şiddetli teratozoaspermia söz konusudur.

Anormal sperm formları aşağıdaki şekillerde olabilir:

 

Sperm Anomalilerinin Tanımlanması:

Kesin kriterler ile sperm morfolojisi değerlendirmesinde yukarıda boyutları verilerek tanımlanan spermler dışında kalan tüm spermler anormal olarak kabul edilir. Anormal sperm formlarını şu  şekillerde özetlemek mümkündür:

Baş Şekil Anomalileri:

a)Borderline (sınırda) baş anomalileri:

Sınırda baş anomalileri, hafif anomaliler olup,ilgili spermi belirli bir anormal form sınıfına sokmaz. Bununla birlikte,ilgili spermi belirli bir anormal form sınıfına da sokmaz. Başın hafifçe uzaması, oval şeklin bir miktar bozulması, baş eninin 1.5-2.0 µm olduğu halde normal bir akrozoma sahip olması durumunda ilgili sperm hafif amorf olarak değerlendirilir. Piriform olarak adlandırılan armut şekilli spermler de bu sınıfa girerler.Tek taraflı kontur bozulması olduğu durumlarda anormal olarak kabul görmez, ancak çift taraflı kontur bozulmaları anomali olarak kabul edilir.

Resim 3: Normal sperm ile Piriform (amorph) karşılaştırması

b)Şiddetli Baş Anomalileri:

Küçük baş: Sperm başı tanımlanan boyutlardan daha ufaktır.

Büyük baş: Sperm başı tanımlanan boyutlardan daha büyüktür.

Elonge (Uzun) baş: Sperm başı tanımlanan boyutlardan uzun olduğu halde akrozomal anomali eşlik etmez. Nüklear bölgede ise şiddetli bir şekil bozukluğu gözlenir. Düzenli olmayan uzun baş formasyonları fertilizasyon ve embriyo gelişimine negatif etki olarak yansıyabilmektedir.

Multiple başlı formlar: Tamamlanmamış seperasyon ve/veya immatürite gösteren sperm grubudur. Parsiyel olarak başlamış olan separasyonun henüz tamamlanamamış formudur.

Serbest baş: Kuyruk ve boyuna sahip olmayan normal veya abnormal morfolojide sperm başlarıdır.

Pin-head: Sperm başının gelişmemiş olduğu, kromozomal yapı içermeyen sperm grubudur.

Tapered sperm: Sperm başının uzun ve sivri olması durumudur. Akrozom anomalisi bu duruma eşlik eder.

Head-base vakuol: Sperm başında boya almayan boşluklardır. Normal bir sperm ikiden fazla vakuol içermemelidir.

Abaksiyel implantasyon: Sperm başı ile orta kısım aynı aks üzerinde değildir.

d) Yuvarlak (Globozoospermia):

Sperm hücresindeki bu morfolojik bozuklukların en önemlilerinden biri akrosom yokluğu ve yuvarlak başlı kafa yapısı , abnormal nüklear zar yapısı ve bunlara eşlik eden midpiece defektleri ile karakterize edilen , prematür kromozom dekondansazyonu sonucu düşük fertilizasyon , düşük gebelik oranları ile sonuçlanan globozoaspermia sendromudur.Akrozom yokluğu veya akrozomal kontentin %40’ın altında olması nedeni ile in-vivo şartlarda veya IUI ,IVF denemeleri ile spermin zona pellucidaya dokunması mümkün olamamaktadır.Globozoaspermia sendromunun gözlendiği hasta grubunun etiyolojisine ilişkin elimizde fazla veri olmamasına karşın temel sorunun ICSI sonrası oositlerin aktive olamaması olduğu ortaya konmuştur.Bu durumda bu sendromun saptandığı hastalarda uygulanacak IUI ve IVF denemeleleri zaman kaybı olacağı gibi hastalara maddi ve manevi yönden gereksiz bir travma olacaktır.Bu sendrom görülen hastalarda, yüksek büyütme  altında ve çift kırılma filtreleri eşliğinde sperm seçilerek sperm boynu ve oositler aktive edilmesi suretiyle mikroenjeksiyon uygulamak başarı şansını arttıtıracaktır. Elde edilen embriyolara preimplantasyon genetik tanımlama ile seçim yapılması gene hastaların gebelik şansını arttırmak için uygulanan tedavilerdendir.

Resim 5: Globozoosperm ile normal başlı sperm arasındaki karşılaştırması

Resim 6: Globozoospermik spermler4in boyama sonrası resimleri

Akrozom Anomalileri

Primer akrozomal anomalileri: Spermin gelişmesi ve diferansiyasyonu sırasında meydana gelen anomalilerdir. Anormal formasyon, anormal dağılım ve sperm başında anormal bağlanma şeklinde ortaya çıkar.

Akrozomal kistler: Primer akrozomal anomalilerdir. Spermac boyama ile akrozom bölgesinde boya almayan parlak alanlar veya çıkıntılar şeklinde  gözükür.

Nipple akrozom: Akrozomun en uç kısmında yer alan kistlerdir.

Aberan akrozom: Homojen olmayan boya dağılımı ve kontur bozukluğu vardır.

Sekonder akrozomal anomaliler: Sperm membranının eksternal etkenler, yaşlanma ve harabiyete bağlı olarak akrozom içeriğinin kaybıdır.

Membran bozulması: Akrozom konturlarının düzenli olmaması durumudur.

Küçük: Akrozomun sperm başının %40’ından daha azını kaplamasıdır.

Büyük: Akrozomun sperm başının %70’inden daha fazlasını kaplamasıdır.

Ayrılmış: Akrozomun sperm başından hafifçe uzaklaştığı görülür.

İrregüler Akrozomal Dağılım: Akrozomal enzimlerin yetersizliği nedeni ile irregüler dağılım gösterip sınırların bozulduğu başlardır.

Nükleus Anomalileri

Nükleus vakuolleri: Çekirdek içinde boşluk alanlar vardır.

Nükleus kistleri: Spermac boya ile boyanmış pembe kısımda yer alan parlak ve çıkıntılı kısımlardır.

Diadem defekti: Sperm başının ekvatoryal sınırına yakın veya üzerinde yer alan çöküntü alanları ve nükleus içine doğru olan girintiler mevcuttur.

Yarık (ridged) baş: Aynı sperm başı içinde birden fazla nükleus bulunması durumunda görülür.

Mid-piece (orta kısım) ve neck (boyun) anomalileri

Segmental mitokondrial aplazi: Orta kısmın belirli bir bölümünün ince ve mitokondriden yoksun olmasıdır.Kayıp bölgenin hemen üzerinde düzensiz droplet görünümünde bir yapı (pseudo droplet) eşlik eder.

Kinked mid-piece: Mitokondrilerin spiral forma girip heliks görüntüsü vermesidir. Mitokondrilerin kaybı sonrası mid-piece kısmında gözlenen bükülme görüntüsüde bu anomaliye aittir.

Kırık boyun: Mid-piece bölgesinden spermin ikiye katlanma görüntüsüdür.

Segmental mitokondial aplazi: Orta kısmın belirli bir bölümünün ince ve mitokondriden yoksun olması durumudur. Genel mid-piece kalınlığından daha dar bir alan olarak boyanırlar.

Bend (Kıvrılmış): Baş ile kuyruk arasında orta kısım zayıflığı veya yokluğu sonucunda baş ile orta kısım sitoplazmik bir parça ile birbirine tutunur.Bu spermlerin progresif motilite göstermeleri söz konusu değildir.

Pseudo droplet: Çok az fakat ekarte edilemeyen sitıolazmik artığın boyun bölgesinde yer alması ile hareketliliği etkileyen mekanik hasarlanma oluşması durumudur.

Sitoplazmik droplet (artık): İmmatürite işaretidir.Boyun kısmında atılan manşetin kalan sitoplazmik kalıntısı boyun kısmına tutunmuştur, genelde testiküler spermlerde gözlenir.Başın yarısından büyük olmamalıdır.

Resim 4: Stoplazmik dropleti olan immatür testiküler sperm hücresi

Non-axiel: Sperm başı ile mid-piece aynı aks üzerinde değildir. Progresif motiliteyi güçleştirir.

Kuyruk anomalileri

Kısa kuyruk: 40mm’den daha kısa kuyruk yapısına sahip spermlerdir. 9+0 ve 9+1 mikrotübüler dizilime sahiptirler ve dynein kollarından yoksundurlar.

Uzun kuyruk: 50 mm’den daha uzun kuyruk yapısına sahip spermlerdir.

Tail-stump: Kısa ve küt  görünümlü sperm yapısına sahip spermlerdir. Genelde 9+0 yada 9+2 mikrotübüler dizilime ve dynein kollarına sahiptirler .Bu sendroma eşlik eden çok sayıda serbest başlı spermi aynı örnek içinde görmek mümkündür. Buna karşın aksonem uzunlukları normalden kısadır ve  mitokondriyel dizilimi koruyan fibröz sheat tabakaları hasarlıdır. Bu yüzden HOS testine cevap vermedikleri için spermlerde düşük vitalite ve total immotilite sözkonusu olduğu durumlarda ardışık örnekleme sonrası cerrahi işlemlere başvurulabilmektedir. Yüksek büyütme altında ve çift kırılma filtreleri eşliğinde sperm seçilerek sperm boynu ve oositler aktive edilmesi suretiyle mikroenjeksiyon uygulamak başarı şansını arttıtıracaktır. Elde edilen embriyolara preimplantasyon genetik tanımlama ile seçim yapılması gene hastaların gebelik şansını arttırmak için uygulanan tedavilerdendir.

Tail Stump sperm örnekleri

Dag defekti: Kuyruğun baş ve orta kısım etrafında kıvrılmasıdır. Kuyruğun hafif kıvrılması, başın etrafında dolanması (orta derecede dag), tam anlamıyla başın etrafında heliks oluşturması (ileri derecede dag) gibi değişik formasyonlarını izlemek mümkündür.

Dag Defekt İçeren Sperm Görüntüleri

Multiple Kuyruk Defekti: Tek bir başa ait birden fazla kuyruğun gözlemlendiği anomali grubudur.

Multiple anomaliler: Baş, boyun ve kuyruk anomalilerinden en az ikisinin aynı spermde bulunması olarak tanımlanır.