INFERTILITE TEDAVİSİNDE GENETİĞİN ÖNEMİ

PGT (Preimplantasyon Genetik Tanımlama) yöntemi dünyada ilk defa 1989 yılında İngiltere’de tek hücre PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) tekniği altında kullanılarak kalıtsal bir hastalık için uygulanmış olup, daha sonrasında  1995 yılında ileri anne yaşı ve tekrarlayan tüp bebek başarısızlığı olan çiftlerde uygulanmaya konulmuştur. 2000 yılında Amerika’da geliştirilen embriyoda genetik tanı ve HLA tipleme çalışmaları ile PGT, salt bir tanı yöntemi olmakla kalmayıp, ailelerin sağlıklı bir bebek sahibi olmasını sağlarken hasta çocukların doğan kardeşlerinden alınan HLA uyumlu kök hücreler ile tedavi olabilmesini de gerçekleştirilmiş böylelikle tüp bebekle sadece sağlıklı bireylerin doğması değil aynı zamanda hasta kardeşe uyumlu sağlıklı bebek elde ederek tedavi imkanı sağlanmıştır. Bu teknoloji tüp bebek çalışmalarına çok daha farklı ve bilimsel bir yaklaşım sağlamıştır.

FISH TEKNİĞİ

Anöplodi (Aneuploidy- sayısal kromozom bozuklukları) ve translokasyonların (yapısal kromozom bozuklukları) tayini için uzun süre  FISH tekniği altın standart olarak kabul edildi. Bu teknik, biyopsi uygulanan hücrelerin cam lama fiksasyonu ile hücre çekirdeğinin eldesi, floresan işaretli prob uygulaması sonrası denatürasyon, hibridizasyon, hibridizasyon sonrası bağlanmayan probların uzaklaştırılması için yıkama, kontrast madde (counterstain) uygulaması ve analiz aşamalarından oluşur. Günümüzde, FISH teknolojisi ile  8,13,14,15,16,17,19,18,20,21,22, X ve Y kromozomları bu teknik ile detaylı incelenebilmektedir,  oluşan ve spontan düşüklerde en sık rastlanan komozomal anomalilerin tespitine dayanan paneller kullanılmakta, bu panel ile de embriyolarda oluşabilecek, kromozomal anomalilerin büyük bir bölümü saptanabilmektedir.



CGH TEKNİĞİ

Sınırlı sayıda kromozomun incelendiği FISH yöntemine alternatif olarak karşılaştırmalı genomikhibridizasyon (CGH, comparativegenomichybridization) yöntemi embriyolarda tüm kromozomların incelenmesini mümkün kılar. Ancak, tekniğin önemli bir dezavantajı vardır o da işlemin uzun sürmesi (yaklaşık 4-5 gün) sebebiyle embriyonun dondurulması zorunluluğunu getirmesidir. Son yıllarda CGH ile aynı prensibe dayanan fakat array tabanlı bir sistem olan array-CGH yönteminin geliştirilmesi ile işlem süresi 48 saate kadar indirilmiş ve bir önceki yönteme göre çözünürlük de yükseltilmiştir.



NGS (NEW GENERATION SEQUICING) TEKNİĞİ

Günümüzde Preimplantasyon Genetik Test – Anöploidi taraması (PGT-A) embriyoda sayısal ve yapısal kromozomalanormalikleri (anöploidi) tespit etmek için kullanılmaktadır. Gebeliğin erken dönemlerinde karşılaşılan düşüklerin büyük çoğunluğu sayısal kromozom anormallikleri ile ilişkilidir, bu nedenle kromozom anormalliği bulunan embriyolar ile gebeliklerin PGT-A tekniği kullanılarak en aza indirilmesi amaçlanmaktadır. PGT-A yönteminde laboratuvar ortamında büyütülmüş embriyolardan (blastosist) biyopsi tekniği ile alınan 50-10 hücre alınmaktadır. Daha sonra Genetik laboratuvarında bu hücre örneklerinin DNA’ları Tüm Genom Amplifikasyonu (WGA) adı verilen özel bir teknik ile çoğaltılır ve sonrasında Yeni Nesil Dizileme (NGS) yöntemi ile analiz edilerek kromozom sayısı ve yapısı incelenir. Bu yöntemin temeli çoğaltılan DNA parçalarının en son teknoloji ile çalışan NGS cihazında sayılarının belirlenmesi ile gerçekleşir. Cihazın okuma işlemleri tamamlandığında Genetik laboratuvarında çalışan Biyolog ve Genetik uzmanı doktorlar birlikte analiz sonuçlarını inceleyerek embriyoların kromozomları hakkında son kararı verirler.

NGS teknolojisi ile daha önceki analiz yöntemleri ile karşılaştırıldığında potansiyel olarak daha hassas ve doğru bir inceleme sağlanmaktadır,
%20 – 80 arası mozaiklik oranları tespit edebilmektedir,
Hücrenin enerjisini sağlayan mitokondriyal DNA miktarını tespit edebilmektedir




EKZOM DİZİLEME (WES ) YÖNTEMİ

Günümüzde karşılaşılan ve tanımlanabilmiş 20.000’e yakın genetik hastalığa tek denemedetanı koyma yöntemiolan, pek çok kalıtsal hastalığın belirlenmesinde daha ekonomik ve hızlı bir yöntem sağlamaktadır. Böylelikle, genlerde  bulunan ,“Ekzom” adı verilen ve gen mutasyonlarının yani genetik hastalıklara neden olan bozulmaların %85’inin kaynağı olan bölgelerin yüksek doğruluk oranıyla incelenebilmesi sağlayan bir yöntemdir.



ANALİZ SONUCU KARAR VE RAPORLAMA
Analiz sonucunda embriyoların Normal (Öploid), Anormal (Anöploid) ya da Mozaik olduğuna karar verilir ve bu şekilde raporlanır.

Normal (Öploid): Her bir kromozomdan doğru sayıda yani 2 kopya sahibi olan embriyolardır. Bu embriyolarda otozom adı verilen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22 kromozomların her birinden 2 kopya bulunmaktadır. Cinsiyet kromozomları ise XX ya da XY şeklinde olacak şekilde çift halinde bulunmaktadır.



Anormal (Anöploid) : Bir ya da daha fazla kromozomunu 2 kopyadan çok ya da az sayıda sahip olan embriyolar. Eğer bir ya da birden çok kromozomu tek kopya olarak bulunan embriyolara Monozomik embriyo adı verilir. Bunun tersi olarak eğer bir ya da daha fazla sayıda kromozomundan üç kopya taşıyan embriyolara ise Trizomik embriyo, 4 kopya taşıyanlara tetraploid adı verilir.



Mozaik : İncelen embriyolardan bir kısmında, embriyoların sonuçları incelendiğinde kromozomların bir ve birkaç kromozomun 2 ile 1 kopya arasında ya da 2 ile 3 kopya arasında bir değerde olduğu tespit edilebilmektedir. Bunun nedeni embriyodan alınan 5-10 sayıda hücrenin bir kısmında kromozom sayısının ikiden az ya da çok sayıda olmasıdır  Bu anormal kromozom sayısına sahip hücreler ile normal sayıda iki kromozoma sahip hücreler bir arada analiz edildikleri için ara değerler görülmektedir. Bu tip anormallik taşıyan embriyolara Mozaik embriyolar adı verilmektedir.

Embriyonikmozaisizm; farklı kromozomal yapıya sahip iki ya da ikiden fazla hücre topluluğu içeren embriyolarda oluşan bir durumdur, birçok hücre bölünme mekanizmasına dayanan bozukluktan dolayı oluşmaktadır. Mozaik embriyoların azalmış implantasyon ve gebelik oranları, artmış genetik anomaliler ve olumsuz gebelik sonuçları ile ilişkili olduğu olduğu ortaya konmuştur. NGS ile hassas olarak raporlanan mozaism oranı ile çiftlere gebelik şansları hakkında daha doğru ve gerçekçi bilgi verebilmek mümkün olmaktadır. Ancak normal yapıda ve sayıda kromozomlara sahip embriyoların transferi her zaman öncelikli olmalıdır. Normal embriyo bulunmadığı durumlarda bazı kromozomları etkilenmiş düşük oranlı mozaik embriyoların transferi hastanın bilgilendirilmiş onamı ile yapılabilir. Mozaik monozomili embriyoların transferi göreceli olarak daha az risk taşımaktadır. Riskli olarak değerlendirilen 2, 7, 13, 14, 15, 16, 18, ya da 21 numaralı kromozomlar için mozaik trizomi tanısı alan embriyonun transferi trizomiksendromlu bir çocuğun doğumuna neden olacağı için önerilmemektedir. Sonuç olarak mozaik embriyo transferi düşünülen çiftlerde her zaman PGDIS (Preimplantasyon Genetik Tanı Uluslararası Topluluğu) kararları doğrultusunda öncelikle normal embriyo bulunması amacıyla yeni bir tüp bebek denemesi tavsiye edilmektedir. NGS yöntemi ile sadece kromozom sayıları değil ayrıca hücrelerde enerji üretiminin yapıldığı mitokondrilere ait DNA’ların da miktarı belirlenebilmektedir



PGT yöntemi günümüze kadar çoğunlukla gebelik kaybı ve kısırlığa sebep olan kromozomal bozuklukların ortaya konulması , ilşeri anne yaşı, anormal gamet morfolojisi, şiddetli erkek faktörüve tüp bebek tedavisindeki başarı şansının arttırılması amacıyla embriyo seçimi yapabilmek amaçlı kullanılmıştır.

Tüm diploid insan hücreleri 22 otozom ve bir gonozomdan oluşan 23 çift kromozom içerir. Bu kromozom kuruluşundaki sayısal bozukluğa anöploidi, fazla (örneğin trizomi) veya eksik (monozomi) sayıda kromozom içeren hücreye anöploid hücre adı verilir.